背景
水稻真菌病害多由真菌孢子引起，真菌孢子是一種小型無性繁殖體，主要通過空氣傳播。分生孢子越多，傳播范圍越廣，尤其是稻瘟菌（Magnaporthe grisea）和稻綠核菌（Ustilaginoidea virens）。全球每年由稻瘟菌造成的水稻產(chǎn)量損失達(dá)數(shù)億公斤。稻綠核菌一旦侵入籽粒，就會直接導(dǎo)致水稻空粒率和癟粒率的增加。因此，了解如何在水稻真菌孢子傳播的早期階段快速捕獲和準(zhǔn)確識別孢子，對于早期病害預(yù)測至關(guān)重要。
空氣成分復(fù)雜，微生物種類繁多，孢子等微生物懸浮在氣流中，處于不斷碰撞和聚集的狀態(tài)。因此，從空氣中有效分離和捕獲孢子成為孢子檢測的首要問題。與傳統(tǒng)的孢子捕獲方法相比，微流控技術(shù)是一種快速、高通量的檢測方法，可以實現(xiàn)自動化分析、集成化、小型化和低消耗。目前已在生物醫(yī)學(xué)、食品檢測和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域大放異彩。
顯微高光譜成像技術(shù)結(jié)合了高光譜和顯微技術(shù)的優(yōu)點。它可以在細(xì)胞水平上對微生物進(jìn)行無創(chuàng)檢測，具有快速、無損的優(yōu)點。它不僅可以采集小目標(biāo)的圖像，還可以同時采集目標(biāo)區(qū)域的光譜信息。目前已被用于開發(fā)真菌生長模擬模型、花生黃曲霉素檢測等研究中。
因此，本研究提出了一種基于微高光譜和微流控技術(shù)的水稻真菌孢子檢測方法。針對稻瘟菌孢子和稻綠核菌孢子設(shè)計了微流控芯片，使芯片能夠分離空氣中的其他顆粒，并在相應(yīng)富集區(qū)域采集這兩種類型的孢子。結(jié)合顯微高光譜成像技術(shù)對孢子進(jìn)行檢測，并根據(jù)孢子的光譜特征建立分類模型，為水稻真菌孢子的早期檢測提供了新方法和新思路。
試驗設(shè)計
江蘇大學(xué)毛罕平教授團(tuán)隊設(shè)計了如圖1a所示的微流控芯片。該芯片可分為三種結(jié)構(gòu)，每種結(jié)構(gòu)都有相應(yīng)的分離通道和富集區(qū)。一級結(jié)構(gòu)設(shè)計為雙入口對稱預(yù)處理通道，其中空氣中的孢子首先通過入口進(jìn)入一級結(jié)構(gòu)，然后通過鞘狀流道。鞘狀流道的主要功能是將含有孢子的氣流擠壓到微通道中，保證進(jìn)入芯片的孢子在微通道中心形成單一的孢子流陣列。在鞘狀流道之后增加一個減速通道，以減少附加慣性力對孢子運動的影響。通道中的孢子在隨氣流移動時也受到慣性的影響。質(zhì)量和尺寸較小的孢子會隨著氣流移動，進(jìn)入分離通道，到達(dá)結(jié)構(gòu)的下一層進(jìn)行分離；而質(zhì)量和大小較大的孢子由于慣性會繼續(xù)向原來的方向移動，最終會沖進(jìn)富集區(qū)。鞘流和分離通道的工作原理分別如圖1b、c所示。
圖1 微流控芯片的二維結(jié)構(gòu)（a）;鞘流工作原理示意圖（b）;分離通道工作原理示意圖（c）
后續(xù)對微流控芯片數(shù)值進(jìn)行模擬分析。利用COMSOL Multiphysics 6.0多物理場仿真軟件對微流控芯片的流場和孢子運動進(jìn)行了數(shù)值模擬，對芯片參數(shù)進(jìn)行了驗證和優(yōu)化。為了獲得更好的模擬結(jié)果，模擬中使用5µm顆粒來表征稻綠核菌孢子，12µm顆粒用來表征稻瘟菌孢子，25µm顆粒用來表征空氣中較大的雜質(zhì)，2µm顆粒用來表征空氣中較小的雜質(zhì)。
本研究采用江蘇雙利合譜公司生產(chǎn)的GaiaMicro系列顯微高光譜成像系統(tǒng)用于孢子高光譜影像的獲取。該系統(tǒng)主要由顯微鏡、V10光柵器件、電荷耦合器件探測器、數(shù)據(jù)采集模塊和計算機(jī)組成。有效波長范圍為400-1000 nm，光譜分辨率為2.8 nm，光譜采樣率為0.7 nm。通過計算每個感興趣區(qū)內(nèi)所有像素的光譜反射率的平均值作為該孢子樣本的光譜數(shù)據(jù)。兩種孢子共獲得300個光譜數(shù)據(jù)。為避免信息的冗余，文中采用競爭自適應(yīng)重加權(quán)抽樣（CARS）用于特征的優(yōu)選，并使用支持向量機(jī)（SVM）和卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（CNN）構(gòu)建最佳孢子分類模型。
結(jié)論
為了找到隱藏參數(shù)的最佳值，并確保每個富集區(qū)域具有最高的富集效率，采用不同范圍的值對隱藏參數(shù)進(jìn)行模擬。發(fā)現(xiàn)當(dāng)通道角θ2為45度、寬度W1和W2均為1800 μm時，顆粒富集效率最高。當(dāng)W4為1000 μm、W3/W4為1.2以及W6為500 μm、W5/W6為1.6時分別對12 μm和5 μm的顆粒富集效率最高。
圖2a-d為本研究設(shè)計的微流控芯片對不同粒徑顆粒富集效果的模擬。粒徑大于或等于18 µm的顆粒由于慣性作用會沖進(jìn)富集區(qū)1a和1b，粒徑小于18 µm的顆粒會隨著氣流進(jìn)入二級結(jié)構(gòu)，粒徑在8 µm ~ 17 µm的顆粒會沖進(jìn)富集區(qū)2。第三階段的分離和富集結(jié)構(gòu)與第二階段相似，粒徑在4 μm ~ 7 μm之間的顆粒進(jìn)入富集區(qū)3，粒徑小于4 μm的顆粒直接從出口排出。微流控芯片通道的速度分布圖如圖5e所示，微流控芯片通道的壓力分布強(qiáng)度圖如圖5f所示。
圖2 富集區(qū)1a和1b為25 µm顆粒（a）;富集區(qū)2為12 µm顆粒（b）；富集區(qū)3為5 µm顆粒（c）；從出口排出2 µm顆粒（d）；微流控芯片通道速度分布（e）；微流控芯片壓力分布（d）
圖3為孢子富集實驗平臺。將制備好的孢子懸浮液放置在氣溶膠發(fā)生器中，空氣經(jīng)氣泵壓縮后送入氣溶膠發(fā)生器，產(chǎn)生生物氣溶膠流。氣溶膠流進(jìn)入擴(kuò)散干燥器以除去水分。烘干機(jī)后連接流量計，將流速設(shè)置為12.5 mL/min，與芯片模擬中的數(shù)值相同。同時，每個鞘流口分別連接另一個微流量計，并設(shè)定鞘流口流量為2.5 mL/min。最后的氣溶膠流進(jìn)入微流控芯片的通道以分離和富集孢子。打開氣泵2 min后，孢子富集實驗完成。富集完成后，用鑷子夾住PDMS膜，緩慢取出。去除PDMS層的微流控芯片放置在顯微鏡下進(jìn)行直接觀察。
圖3 孢子富集實驗平臺
圖4展示了富集區(qū)2和富集區(qū)3的微高光譜影像。可以發(fā)現(xiàn)仍有少量極小顆粒附著在稻瘟菌孢子上一起進(jìn)入富集區(qū)，但本實驗平臺已具有良好的凈化效果。同時稻綠核菌孢子在富集區(qū)分布較為均勻。最終，本研究設(shè)計的微流控芯片對稻瘟菌孢子和稻綠核菌孢子的實際富集效率分別為82.67%和80.70%。
圖4 稻瘟菌孢子富集結(jié)果（a）；稻綠核菌孢子富集結(jié)果（b）
本研究使用CARS算法進(jìn)行特征優(yōu)選（圖5）。隨著CARS算法迭代次數(shù)的增加，總體上保留的波段數(shù)量在不斷減少，但減少的速度由快變慢，這是由于CARS算法在特征波段篩選過程中從粗篩選到細(xì)篩選的變化。從RMSECV的變化趨勢可以看出，隨著樣本數(shù)量的增加，RMSECV有減小的趨勢。當(dāng)樣本數(shù)量為6個時，REMSECV最小，所選擇的特征子集最優(yōu)。最終選取了34個特征波長，占總波段的5.67%。
圖5 CARS特征篩選結(jié)果
表1和表2分別展示了不同模型的分類結(jié)果以及分類指標(biāo)結(jié)果。以CARS篩選后的波段為變量的分類模型優(yōu)于以全波段為變量的分類模型。通過比較CARS-SVM和CARS-CNN分類模型，發(fā)現(xiàn)兩種模型對稻瘟菌孢子的分類結(jié)果相似。而CARS-CNN模型對于稻綠核菌孢子的分類結(jié)果中，其二級指標(biāo)中的準(zhǔn)確率、精確率、召回率和特異性分別為0.960、0.950、0.970和0.950，三級指標(biāo)的F1得分為0.960，遠(yuǎn)高于CARS-SVM分類模型。F1得分越接近1，說明分類效果越好。因此，CARS-CNN分類模型在稻綠核菌孢子分類中更有優(yōu)勢。
表1 不同模型的分類結(jié)果
表2 不同模型分類指標(biāo)結(jié)果
作者信息
毛罕平，博士，江蘇大學(xué)農(nóng)業(yè)工程學(xué)院教授，博士生導(dǎo)師。
主要研究方向：現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)及環(huán)境自動控制技術(shù)、智能化農(nóng)業(yè)裝備技術(shù)、生物信息探測與傳感技術(shù)、移栽機(jī)械。
參考文獻(xiàn)：
Zhang, X.D., Song, H.J., Wang, Y.F., Hu, L., Wang, P., & Mao, H.P. (2023). Detection of Rice Fungal Spores Based on Micro- Hyperspectral and Microfluidic Techniques. Biosensors (Basel), 13.
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